实验九 肝组织中核酸的分离与鉴定

【原理】

组织细胞中的核糖核酸（RNA）与脱氧核酸（DNA）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。核蛋白质被三氯醋酸沉淀后，用10%NaCl溶液提取核酸的钠盐，再加入醇可使核酸钠沉淀析出。

RNA与DNA均可被硫酸水解产生磷酸、有机碱（嘌呤和嘧啶）和戊糖（RNA含核糖，DNA含脱氧核糖），此三类化合物可用下述方法鉴定之。

（1）磷酸与钼酸铵作用产生磷钼酸，后者在还原剂氨萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。

（2）嘌呤碱与硝酸银产生灰褐色的嘌呤银化合物。

（3）核糖经浓盐酸或浓硫酸作用生成糖醛，后者和3,5-二羟甲苯缩合而成绿色化合物。

（4）脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟[基]-γ-酮[基]戊醛，它与二苯胺作用生成蓝色化合物。

【操作】

（1）制备匀浆：将小白鼠1只，拉断脊椎致死，部腹取出全部肝组织，用清水冲净血污后，用滤纸吸干，用剪刀剪碎，再加0.9%NaCl液2mL于研钵中制成匀浆。

（2）分离提取：取全部匀浆于离心管（或小试管）内，加2%三氯醋酸2mL，用玻棒搅匀，静置3分钟，3000r/min离心3分钟。弃上清液，于沉淀中加入10%NaCl液2mL，充分混匀，置沸水浴中加热8分钟，用玻棒边加热边搅拌（防止玻管底破裂），使之充分生成核酸钠化合物。取出放冷，3000r/min离心3分钟。将上清液倒入另一试管内，逐滴加入95%冷乙醇2mL，边加边搅拌，待析出白色沉淀。静置5分钟后，再3000r/min离心5分钟，倒去上清液后沉淀备用。

（3）核酸水解：于上述沉淀（核酸钠）中加入5%H2SO44mL，用玻棒搅匀，在沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液。

（4）RNA与DNA成分的鉴定：

嘌呤碱的鉴定：取中试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加入各试剂（表2-9-1）。

加入AgNO3后，置沸水浴中5分钟，观察两管颜色有何变化。

磷酸的鉴定：取长试管2支，分别标明测定管与对照管，然后依次加入各试剂（表2-9-2）。

充分混匀，放置3分钟，再置于沸水浴中3分钟，比较两管颜色。

核糖的鉴定：取长试管2支，分别标明测定管与对照管，然后依次加各试剂（表2-9-3）。

将两试管放入沸水浴内加热5分钟，比较两管之颜色。

脱氧核糖的鉴定：取长试管2支，分别标明测定管与对照管，依次加入各试剂（表2-9-4）。

将两管同时放入沸水浴中，5分钟后观察管颜色之差别。

【试剂】

（1）2%三氯醋酸。

（2）95%乙醇。

（3）0.9%NaCl溶液。

（4）10%NaCl溶液。

（5）5%H2SO4溶液。

（6）5%AgNO3溶液。

（7）钼酸铵试剂：在20mL水中溶解2.5g钼酸铵加5 mol/L H2SO430mL，用水稀释至100mL。此试剂可在冰箱中保存30天。

（8）氨[基]萘酚磺酸：市售氨[基]萘酚磺酸（1,2,4-Aminonaphthal-Sulfonic acid）为暗红色，可纯炼如下：在100mL热水（90℃）中溶解15gNaHSO4及1g Na2SO4，加1.5g商品氨[基]萘酚磺酸，搅匀使其大部分溶解（仅少量杂质不溶解），趁热过滤，再迅速使滤液冷却。加1mL浓盐酸（12mol/L）有白色氨[基]萘酚磺酸沉淀析出，过滤并用水洗涤固体数次，再用乙醇洗涤，直至纯白色为止，最后用乙醚洗涤，并将固体放置在暗处，使乙醚挥发，将此提纯的氨[基]萘酚磺酸保存于棕色瓶中。

取15%NaHSO3溶液195mL（必须透明），加入0.5g纯化的氨[基]萘酚磺酸及20%液Na2SO35 mL。并在热水浴中搅拌使固体溶解（如不能全部溶解，再加20%Na2SO3溶液每次数滴，但加入量以1mL为限度），置冷处可保存2～3周，如颜色变黄时，要重新配制。

（9）二苯胺试剂：取1g纯的二苯胺溶于100mL冰醋酸（AR）中，加入2.75mL浓硫酸，放在棕色瓶中，此试剂也须临时配置。

（10）3,5-二羟甲苯试剂：取比重1.19 HCl100mL加入FeCl3·6H2O 100mg及二羟甲苯100 mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在使用前新鲜配制。市售之3,5-二羟甲苯必须用苯重结晶1～2次，并用活性碳脱色方可使用。