第六节 纳豆激酶免疫脂质体
一、纳豆激酶免疫脂质体的制备
制备三批纳豆激酶脂质体，[50]平均包封率为53.44%（RSD=3.82%）。采用对甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）法测定纳豆激酶活性，活性单位为TAME ；U/mL。
取偶合剂EDCI将McAb SZ-63偶联到纳豆激酶脂质体表面。具体操作：在10mL脂质体悬液中加入5.0mg/mL EDCI溶液0.5mL和1.0mg/mL McAb SZ-63 0.1mL，置于冰水浴中磁力搅拌2h即可。
葡聚糖凝胶G-25柱（1.5cm×22cm）预先用0.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液平衡，将上述反应后的脂质体悬液上柱，每次2.0mL，用上述PBS洗脱，流速1.0mL/min。洗脱约17min后从流出的洗脱液出现乳光开始收集洗脱液，每瓶收集4mL，连续收集10瓶。收集的第1瓶洗脱液有明显的乳白色乳光；第2瓶只有很浅的乳光，两瓶流出组分均为纳豆激酶免疫脂质体；第3瓶澄清流出组分已测不出纳豆激酶活性。
二、制备免疫脂质体过程中纳豆激酶活性的变化
1.纳豆激酶溶液的长期稳定性
用磷酸盐缓冲液配制浓度为0.22mg/mL的纳豆激酶溶液，将溶液加入具塞西林瓶中，置于4℃保存。分别于0、1、2、3、5、6、10、27天取样，测定纳豆激酶活性并计算其平均值和相对标准偏差。0天时测得活性为0.420 TAME U/mL，27天中纳豆激酶活性平均值为0.434 TAME U/mL（RSD=6.42%）。可见，纳豆激酶在上述条件下保存，活性稳定。
2.旋转蒸发时间对纳豆激酶活性的影响
用PBS配制浓度为0.32mg/mL纳豆激酶溶液，置于25℃恒温水浴中以120 r/min旋转蒸发，分别于0、30、60、90、120、150、180min取样1.0mL，测定活性，结果见表4-12。
表4-12 旋转蒸发时间对纳豆激酶活性的影响（n=3）
由表4-12可见，25℃恒温旋转蒸发180min时纳豆激酶活性保留率在94%以上，120min以内活性保留率在95%以上。
3.EDCI对纳豆激酶活性的影响
用磷酸盐缓冲液配制浓度为0.25mg/mL纳豆激酶水溶液，测得其活性为（0.468±0.025）TAME U/mL。将配制的溶液分为两组，其中一组加入EDCI至终浓度为0.25mg/mL；另一组不加。两组均置于4℃保存，24h后测定活性。结果，不含EDCI组纳豆激酶活性为（0.459±0.018）TAME U/mL，含EDCI组活性为（0.450±0.020）TAME U/mL。可见，EDCI的加入对纳豆激酶活性影响不大[50]。
4.搅拌对纳豆激酶活性的影响
用磷酸盐缓冲液配制浓度为0.25mg/mL纳豆激酶水溶液，测得其活性为（0.450±0.021）TAME U/mL。将配制的溶液分为两组，其中一组加入EDCI至终浓度0.25mg/mL；另一组不加。两组均置于冰水浴中磁力搅拌2h，分别测定纳豆激酶活性。结果，不含EDCI组测出的活性为（0.449±0.015）TAME U/mL，含ED-CI组为（0.477±0.019）TAME U/mL。可见，含EDCI的纳豆激酶溶液在冰水浴中磁力搅拌2h对纳豆激酶活性的影响不大。
5.葡聚糖凝胶G-25柱层析对纳豆激酶活性的影响
取用PBS配制的浓度为0.25mg/mL的纳豆激酶水溶液分成三组，测定其纳豆激酶活性为（0.461±0.017）TAME U/mL。分别取上述三组溶液2mL上柱，以PBS为洗脱液，流速1mL/min，洗脱17min后开始收集洗脱液，每瓶收集4mL，连续收集10瓶。流出的组分依次为空白洗脱液、纳豆激酶液、空白洗脱液。测定纳豆激酶液流出段中纳豆激酶的活性，计算得到纳豆激酶的柱回收率平均值为99.73%（RSD=5.53%），说明柱层析对纳豆激酶活性影响不大[50]。
三、纳豆激酶免疫脂质体冻干品的制备
取过柱收集到的脂质体悬液10mL移至分子截留量为12 000 u（1 u=1 D）的透析袋中，放入培养皿，向透析袋上撒满聚乙二醇（PEG）6000的干粉末，4℃保存。待脂质体悬液浓缩至约2mL，将悬液转移出透析袋并分装到西林瓶中，每瓶2.0mL，厚度约为10 mm，置于-40℃冰箱急速冷冻。转移至冻干机中，启动真空泵，当干燥箱内的真空度达到0.1 mmHg以下时关闭冷冻机，缓缓加热，使冻结产品的温度逐渐升高至-20℃，药液中的水分升华，24h后从冻干机中取出冻干品即得。
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