实验9 氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定
一、实验目的
1.掌握紫外-可见分光光度计的工作原理与基本操作。
2.学习紫外-可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。
3.了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。
二、实验原理
紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并记录该物质在每一波长处的吸光度（A），然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。
当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c及厚度b成正比。其数学表达式为：
（1）
上式为朗伯-比耳定律，是分光光度法定量分析的基础，其中T为透光率（透射比）。
物质的吸收光谱反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况。不同的物质，由于分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来。因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息。
氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（<220nm）均有光吸收，在紫外区（近紫外区）（220～300nm）只有三种氨基酸有光吸收，这三种氨基酸分别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，因为它们的结构均含有苯环共轭双键。苯丙氨酸最大吸收波长在259nm、酪氨酸在278nm、色氨酸在279nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280nm波长处，因此能利用分光光度法很方便地测定蛋白质的含量（见图1）。
图1 不同种类芳香族氨基酸的紫外吸收光谱
本实验将对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸进行光谱测定及相关定量测定。
三、仪器和试剂
仪器：紫外-可见-近红外分光光度计（UV-1800）；分析天平；（0.5mL、1.0mL、2.0mL）移液管若干；10mL带塞比色管若干。
试剂：
标准溶液a：2.0g·L-1的苯丙氨酸溶液。
标准溶液b：0.4g·L-1的酪氨酸溶液。
标准溶液c：0.4g·L-1的色氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）。
酪氨酸待测样。
四、实验步骤
1.分别移取标准溶液a（2.0g·L-1，1.0mL）、标准溶液b（0.4g·L-1，1mL）和标准溶液c（0.4g·L-1，0.4mL）于10mL比色管中，用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。
2.分别移取0.0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL标准溶液b于5个10mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。
3.双击分光光度计图标“UVProbe”，出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束，预热15～30min。待仪器稳定后方可使用。
4.在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤1中各溶液在200～350nm波长范围内的吸收光谱，并记录各标准溶液的λmax。
5.在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤2中的各标准溶液在λmax处的吸光度。
6.在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。
五、数据处理
1.将苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光谱叠加在一个坐标系中，比较它们吸收峰的变化，说说有什么不同，为什么？
2.以上述步骤测得的各酪氨酸标准溶液的吸光度为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制工作曲线，再根据未知溶液的吸光度，利用标准曲线求出待测样的浓度。
六、思考题
1.本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的，是否可以在波长较短的吸收峰下进行定量测定，为什么？
2.被测物浓度过大或过小对测量有何影响？应如何调整？调整的依据是什么？
3.思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据，并设计相应的实验方案，测定奶粉中蛋白质的含量。