实验10　紫外-可见分光光度法测定鸡蛋中蛋白质的含量

一、实验目的

1.熟练掌握紫外-可见分光光度计的工作原理与基本操作。

2.学习紫外-可见吸收光谱法应用于实际样品测定的方法。

3.学习如何选择显色反应的最佳实验条件。

二、实验原理

鸡蛋含有丰富的营养成分，如蛋白质、脂肪、钙、铁等微量元素等，是人类最好的营养来源之一。随着市场经济的发展，市面上开始流行名目繁多的鸡蛋，如土鸡蛋、草鸡蛋、洋鸡蛋等，它们之间价格差异很大，甚至达两倍以上。消费者在面对这些鸡蛋时往往存在疑惑，不知道价格高的草鸡蛋、土鸡蛋是否具有更高的营养价值。本实验将利用紫外-可见分光光度计对不同鸡蛋中蛋白质的含量进行测定，用数据来解开市场上名目繁多的鸡蛋的“神秘面纱”。

蛋白质在碱性溶液中能与Cu²⁺形成紫红色络合物，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度，该方法称为双缩脲法。

三、仪器和试剂

仪器：紫外-可见-近红外分光光度计（UV-2401）（见图1）；分析天平；离心管若干；10mL带塞比色管若干。

试剂：鸡卵清蛋白标样；乙酸铵溶液（1.0mol·L^-1）；硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）；酒石酸钾钠（NaKC₄H₄O₆·4H₂O）；新鲜鸡蛋三种：草鸡蛋、土鸡蛋、洋鸡蛋。

四、实验步骤

1.待测样品预处理

（1）三种鸡蛋各取一枚，分离出蛋清和蛋黄，分别置于干燥洁净的烧杯中，称取4.0g的蛋清、2.0g蛋黄，再加入乙酸铵溶液，使每份样品总质量达25.0g。

（2）将6份样品放在磁力搅拌器上搅拌15min。

（3）将搅拌后的样品移至离心管中，在10000r·min^-1条件下离心20min，取出，待用。

2.双缩脲试剂的配制

取0.75g CuSO₄·5H₂O和3.0g NaKC₄H₄O₆·4H₂O，用250mL水溶解，在搅拌下加入150mL 10%氢氧化钠溶液及0.5g KI；用水稀释定容到500mL，避光保存。

3.蛋白质标样的配制

准确称取鸡卵清蛋白标样100mg，置于10mL比色管中，用1.0mol·L^-1乙酸铵溶液定容至10mL，充分摇匀。配成浓度为10mg·mL^-1的卵清蛋白标准溶液。

分别移取10mg·mL^-1卵清蛋白标准溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于6支5mL比色管中，分别加入4mL双缩脲试剂，用乙酸铵溶液定容。摇匀，在室温下放置30min，待用。

4.光谱测定

在光谱测定模式下，以乙酸铵为参比溶液，在200～800nm的波长范围内，对样品进行光谱测量，并记录样品的λ_max值。

5.绘制标准工作曲线

在定量测定模式下，以乙酸铵为参比溶液，测定并记录系列标准样品在λ_max处的吸光度值。

6.测量系列待测样品

分别移取0.2mL蛋清和蛋黄样品于5mL比色管中，各加入4mL双缩脲试剂，用乙酸铵溶液定容、摇匀，在室温下放置30min。以乙酸铵为参比溶液，测定并记录每一个样品溶液在λ_max处的吸收值。

五、数据处理

绘制标准工作曲线，根据标准工作曲线求出各待测样品的蛋白质含量。

六、思考题

1.选择显色反应的最佳条件的依据是什么？

2.本实验中测定鸡蛋中蛋白质含量的依据是什么？应用紫外-可见分光光度计能否有其他方法测定蛋白质的含量，若有，请设计合理的实验方案。